Controllo della carica patogena e delle muffe in un ambiente dove non è possibile usare disinfettanti.

Caso di studio: sanificazione e sterilizzazione senza utilizzo di disinfettanti a base di cloro diluito, tramite la produzione di gas ozono.

E possibile che nelle applicazioni per la sanificazione o sterilizzazione batterica vengono usati disinfettanti a base di cloro (diossido di cloro), Perossido di idrogeno, oppure a base alcool. Questa procedura, valida dal punto di vista dell’abbattimento della flora patogena, trova grosse problematiche di applicazione in quei settori dove la miscela acqua-disinfettante lascia dei residui tossici (cloro) o contribuisce ad aumentare l’umidità nell’ambiente innescando lo sviluppo incontrollato di muffe.
Uno dei settori particolarmente sensibile a questa problematica è il settore agro-alimentare in particolare quello caseario; in questo caso tratteremo il problema del trattamento dell’aria negli ambienti di stagionatura dei formaggi.

Per prima cosa facciamo un richiamo generale sull’ozono; cos’è l’ozono?
L’ozono (dal greco ozein=odore) è un gas la cui molecola è costituita da 3 atomi di ossigeno O3 .
E’ presente in natura come gas blu dall’odore acre e pungente, (particolarmente riconoscibile dopo un temporale) nella concentrazione di circa 0.04ppm (1ppm=2mg/m3). Infatti tale gas si forma naturalmente nell’atmosfera, in particolare nell’ozonosfera a circa 25Km di altezza. La quantità di ozono si mantiene costantemente in equilibrio dinamico fra la reazione di formazione e quella di fotolisi.

FORMAZIONE

Potenti scarica elettriche(fulmini) e radiazioni UV (hv) inferiori a 242nm dissociano le molecole diossigeno in ossigeno atomico secondo la reazione di Chapman:

O2+HV -> O+O

L’ossigeno atomico si combina velocemente con un’altra molecola di ossigeno formando la molecola triatomica dell’ozono (O3). L’effetto finale della reazione è la conversione di tre molecole di ossigeno O2 in due molecole di ozono O3.

DISGREGAZIONE O FOTOLISI

Il legame della molecola di ozono è un legame instabile, infatti a loro volta le molecole assorbono radiazioni solari con lunghezza d’onda compresa fra 240 e 320 nm, subendo la fotolisi e rilasciando ossigeno molecolare O2 ed ossigeno atomico.
Assorbendo le radiazioni con queste lunghezze d’onda, che sono proprie di raggi ultravioletti, l’ozono svolge il suo compito di schermatura delle terra da più del 90% dai dannosissimi raggi ultravioletti (UV) Questo, abbiamo detto, avviene nella ozonosfera; in vicinanza della superficie terrestre (troposfera) questa reazione non avviene in quanto i raggi UV sono quasi totalmente schermati; i bassi livelli che si misurano normalmente a livello terrestre sono dovuti quasi esclusivamente allo scambio tra ozonosfera e troposfera e da una minima quantità prodotta mediante il ciclo fotolitico dell’azoto; tale reazione viene amplificata da inquinanti derivati dalla combustione (veicoli a motore, centrali termoelettriche ecc.)

La formazione dell’ozono può avvenire anche industrialmente, attraverso gli ozonizzatori, strumenti che generano una corrente gassosa ricca di ossigeno, a cui viene applicata un’energia elettrica che determina una ionizzazione dell’aria tipica dei fulmini.

PROPRIETA’

L’ozono è un gas solubile in soluzione acquosa, molto più dell’ossigeno stesso, con una solubilità inversamente proporzionale alla temperatura al PH; con l’aumento delle temperatura si osserva una drastica riduzione dei tempi di emivita. Allo stato gassoso l’emivita è meno influenzata dalla temperatura, a 20° l’ozono possiede una tempo di emivita di circa 20 minuti.
L’ozono è una molecola con alto potenziale di ossidazione, più del perossido di idrogenoe del cloro, (vedi tabella A).

L’alto valore ossidante permette all’ozono di ossidare numerosi composti organici (fenoli, benzene, trialometani, pesticidi) ed inorganici (cianuri, solfiti, nitriti). l’ozono, inoltre è in grado di ossidare il ferro, il manganese ed altri minerali, che soprattutto se complessati, possono essere molto difficili da rimuovere. A livello cellulare, anche i principali effetti tossici dell’ozono sono riconducibili al suo alto potere ossidante e quindi alla capacità di ossidare e perossidare le biomolecole, sia direttamente che indirettamente.

Tabella A. Potenziale di ossidazione degli agenti ossidanti

Sostanza	Potenziale redox(V)
Fluoro	2.87
Idrossiradicale (OH)	2.86
Ione persolfato(S2O8)	2.60
Ossigeno atomico (O)	2.42
Ozono (O3)	2.07
Perossido di Hidrogeno (H2O2)	1.78
Cloro (CLO2)	1.36
Diossido di Cloro(CLO2 )	1.27
Molecola dio ossigeno(O2)	1.23

Come si può notare la forza ossidante dell’ozono è decisamente maggiore dei più conosciuti Diossido di Cloro e Perossido di Idrogeno.

L’ozono decomponendosi rapidamente in fase acquosa può dare origine ad una serie di specie reattive dell’ossigeno (ROS Reacting oxigen species) anche chiamati radicali liberi, quali l’anione radicale superossido, il radicale idrossilico (HO) e il perossido di idrogeno, che causano alterazioni della struttura e funzione delle macromolecole biologiche.

Il principale meccanismo di azione dell’ozono, e più in particolare dei ROS, è la perossidazione lipidica, che genera composti biologicamente attivi che a livello cellulare causano danni ai fosfolipidi di membrana.

La tossicità dell’ozono dipende, inoltre, dalla sua capacità di ossidare gli aminoacidi alterando irreversibilmente la struttura e la funzione delle proteine. Gli aminoacidi più sensibili all’azione dei radicali liberi sono prolina, istidina, cisteina, metionina; e gruppi aromatici come fenilalina, tirosina, triptofano.

I ROS possono causare con la loro azione severi danni ossidativi specialmente a carico di DNA, lipidi e proteine. Numerosissime sono le attività metaboliche che portano alla produzione di ROS. La presenza di ROS è quindi un fenomeno fisiologico nel corpo umano: è l’eccesso di questi radicali liberi che è in grado di determinare uno stato patologico. Nelle applicazione con l’ozono, l’eccesso di radicali liberi si raggiunge con esposizioni continuative.

OZONO COME AGENTE DISINFETTANTE

L’azione ossidante esplicata dall’ozono ha fatto sì che sin dalla sua scoperta fosse utilizzato come agente battericida, fungicida e inattivante dei virus (Tabella 2). Esso è stato utilizzato inizialmente come agente disinfettante nella produzione di acqua potabile, in Francia dal 1906 ed in Germania dal 1972. La scelta dell’ozono fu basata sul fatto che esso è più efficace di altri disinfettanti verso un più ampio spettro di microorganismi.

I diversi batteri mostrano una sensibilità variabile all’ozono: i Gram-negativi sono meno sensibili dei Gram-positivi, i batteri sporigeni si dimostrano più resistenti dei non sporigeni. Poiché il meccanismo con cui agisce l’ozono è la perossidazione lipidica, la causa della differente sensibilità sarebbe imputabile alla differente composizione lipidica della parete batterica. L’inattivazione dei virus è stata finora meno studiata di quella dei batteri; è comunque noto che anch’essa avviene rapidamente in seguito ad ozonizzazione, anche se richiede una somministrazione di gas a concentrazioni superiori rispetto a quella necessaria per i batteri. Si è osservato, infatti, che le curve di inattivazione mostrano un rapido abbattimento delle colture fino al 99%; il restante 1% richiede un tempo maggiore per la totale inattivazione. Vari studi effettuati sulla sensibilità dei virus all’ozono hanno dimostrato che i virus provvisti di membrana sono nettamente più sensibili di quelli che ne sono sprovvisti.

Il meccanismo di azione dell’ozono sui virus non è sicuramente quello di una distruzione, come nel caso dei batteri, ma di un’inattivazione; l’azione dell’ozono consisterebbe in un’ossidazione, econseguenteinattivazione,deirecettoriviralispecificiutilizzatiperlacreazione del legame con la parete della cellula da invadere. Verrebbe così bloccato il meccanismo di riproduzione virale a livello della sua prima fase: l’invasione cellulare.

Nella Tabella B sono riportati i tempi indicativi per l’eliminazione di alcuni agenti patogeni.

Tabella B. Inattivazione di batteri, virus, funghi, muffe ed insetti in seguito ad ozonizzazione
(Fonti: Edelstein et al., 1982; Joret et al., 1982; Farooq and Akhlaque,1983; Harakeh and Butle, 1985; Kawamuram et al. 1986)

ORGANISMO	CONCENTRAZIONE	TEMPO DI ESPOSIZIONE
BATTERI (E. Coli, Legionella, Mycobacterium, Fecal Streptococcus)	0,23 ppm – 2,2 ppm	< 20 minuti
VIRUS (Poliovirus type-1, Human Rotavirus,Enteric virus)	0,2 ppm – 4,1 ppm	< 20 minuti
MUFFE (Aspergillus Niger, vari ceppi di Penicillum,Cladosporium)	2ppm	60 minuti
FUNGHI (Candida Parapsilosis, Candida Tropicalis)	0,02 ppm – 0,26 ppm	< 1,67 minuti
INSETTI (Acarus Siro, Tyrophagus Casei, Tyrophagus Putrescientiae)	1,5 – 2 ppm	30 minuti

La caratterista predominante dell’ozono è che in condizioni atmosferiche standard è in fase gassosa, favorendo numerose applicazioni in campo igienico-alimentare. A differenza dei disinfettanticlassici, (es. il cloro) che rilasciano residui inquinanti, l’ozono si decompone ad ossigeno; ciò un vantaggio per l’ambiente e per la salute evitando gli effetti collaterali dei residui tossici.

Vista la sua breve emivita, l’ozono non può essere prodotto e conservato, ma è necessario che venga generato in situ al momento dell’utilizzo attraverso gli ozonizzatori. Tuttavia, sebbene a basse concentrazioni non sia particolarmente tossico, ad alte concentrazioni può avere effetti gravi. I principali danni sono a carico delle vie respiratorie per alterazione della permeabilità degli epiteli, con conseguente riduzione della funzionalità polmonare (fino ad edema); può inoltre determinare un peggioramento in soggetti con bronchite o asma.

L’ozono è anche causa di altri disturbi quali bruciore agli occhi, mal di testa, debolezza. Pertanto, la tossicità dell’ozono richiede che gli addetti al suo utilizzo siano continuamente monitorati e che le procedure siano applicate scrupolosamente. In conformità alle norme H.A.C.C.P e D.Lgs. 626/94, chi ne fa utilizzo non deve essere esposto a più di 0,1 ppm di ozono in 8 ore o più di 0,3 ppm due volte/die per 15 minuti (si noti che la soglia di percettibilità olfattiva per l’uomo è a concentrazioni tra 0,02 e 0,05 ppm, pari a circa 1/20 della soglia di concentrazione definita sicura per un tempo di esposizione di 15 minuti ed a circa 1⁄4 della soglia di esposizione definita sicura negli ambienti di lavoro).

UTILIZZO DELL’OZONO NELLA STAGIONATURA DEI FORMAGGI

Numerosi funghi e batteri trovano nel formaggio un eccellente mezzo di crescita. Soprattutto nei casi dei formaggi stagionati l’ambiente areato determina un incremento della proliferazione dei microorganismi, causando danni al prodotto. Durante la conservazione refrigerata, sui formaggi si sviluppano principalmente batteri appartenenti alla specie Penicillium che rilasciano nei formaggi micotossine, quali patulina, acido micofenolico, ocratossina A e citrinina.

I metodi tradizionali atti a controllare la crescita di lieviti, muffe e batteri tuttavia risultano costosi e poco efficaci, pertanto è sorta la necessità di trovare metodiche alternative. Già nel 1951, si dimostrò che la crescita di muffe sui formaggi durante la stagionatura poteva essere prevenuta utilizzando 1 ppm di ozono. Nel 1960, in Canada, venne condotto uno studio sul “Cheddar cheese” dimostrando che a concentrazioni di ozono tra 3- 10 ppm la crescita delle muffe sulla superficie orizzontale del formaggio assumevano una colorazione scura; il numero delle spore rilevate nell’ambiente era ridotto del 96% rispetto alle camere non trattate. E’ importante notare che anche a concentrazioni più basse (0,2-0,3 ppm) si osservava una significativa riduzione delle muffe senza alcuna alterazione delle proprietà organolettiche del prodotto. Negli anni 70, si confermarono tali scoperte dichiarando che l’ozono a 10 ppm inattivava totalmente le spore.

E’ stato anche valutato l’effetto dell’ozono su insetti. I prodotti immagazzinati possono essere principalmente attaccati da Acarus siro, Tyrophagus casei (cosiddetto “acaro del formaggio”), Tyrophagus putrescentiae.

E’ stato osservato che il trattamento regolare con ozono porta alla loro eliminazione, anche se il meccanismo non è ancora del tutto noto. Tuttavia, è stato anche riportato che gli insetti cercano rifugio dove l’ozono non penetra, occupando gli interstizi e scavando buche nel formaggio.

Nel 2003, è stato dimostrato che l’impiego di ozono gassoso nelle camere di stagionatura dei formaggi favorisce l’eliminazione delle muffe presenti nell’ambiente di stagionatura e non quelle già presenti nel formaggio, non alterando così i normali processi di fermentazione e stagionatura.